Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Ny vectors génétique amin'ny fitsaboana ny fibrosis cystika pulmonary dia tsy maintsy lasibatra amin'ny lalan-drivotra conductive, satria tsy misy fiantraikany amin'ny fitsaboana ny fampidinana ny havokavoka periferika.Ny fahombiazan'ny transduction viriosy dia mifandray mivantana amin'ny fotoana ipetrahan'ny mpitatitra.Na izany aza, miparitaka ho azy ao amin'ny alveoli ny ranon-javatra mampita toy ny mpitatitra fototarazo mandritra ny fifohazana, ary ireo poti-panafody na inona na inona endrika dia esorina haingana amin'ny alàlan'ny fitaterana mucociliary.Ny fanitarana ny fotoana ipetrahan'ireo mpitatitra fototarazo ao amin'ny trakta taovam-pisefoana dia zava-dehibe saingy sarotra ny manatratra izany.Ny poti-magnetika mifamatotra amin'ny mpitatitra izay azo alefa eny amin'ny tampon'ny trakta taovam-pisefoana dia afaka manatsara ny tanjona isam-paritra.Noho ny olana amin'ny in vivo imaging, ny fitondran-tenan'ny poti-magnetika kely toy izany eo amin'ny lalan-drivotra amin'ny fisian'ny sahan'andriamby ampiharina dia tsy takatry ny saina.Ny tanjon'ity fandalinana ity dia ny fampiasana sary synchrotron mba hijerena amin'ny vivo ny fihetsiky ny andiam-pirazanana magnetika ao amin'ny trachea an'ny voalavo anesthetized mba handinihana ny dinamika sy ny lamin'ny fitondran-tenan'ny singa tokana sy ampahany amin'ny vivo.Avy eo dia nanombantombana ihany koa raha mety hampitombo ny fahombiazan'ny transduction ao amin'ny trachea voalavo ny fandefasana poti-magnetika lentiviral amin'ny fisian'ny sahan'andriamby.Ny sary X-ray synchrotron dia mampiseho ny fihetsiky ny poti-magnetika ao amin'ny saha andriamby tsy mihetsika sy mihetsika in vitro sy in vivo.Tsy azo taritina mora foana eny ambonin'ny lalan-drivotra miaina amin'ny alalan'ny andriamby ny sombin-javatra, fa mandritra ny fitaterana, ny tahiry dia mifantoka amin'ny sehatry ny fijery, izay matanjaka indrindra ny sahan'andriamby.Nitombo avo enina heny ihany koa ny fahombiazan'ny transduction rehefa naterina tamin'ny fisian'ny sahan'andriamby ny lentiviral.Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny singa magnetika lentiviral sy ny sahan'andriamby dia mety ho fomba fiasa manan-danja hanatsarana ny tanjona sy ny haavon'ny transduction amin'ny lalan-drivotra conductive in vivo.
Ny cystic fibrosis (CF) dia vokatry ny fiovan'ny fototarazo tokana antsoina hoe CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Ny proteinina CFTR dia fantsona ion izay hita ao amin'ny sela epithelial maro manerana ny vatana, anisan'izany ny lalan-drivotra, toerana lehibe amin'ny pathogenesis ny cystic fibrosis.Ny lesoka ao amin'ny CFTR dia mitarika amin'ny fitaterana rano tsy ara-dalàna, ny tsy fahampian'ny rano amin'ny lalan-drivotra, ary ny fihenan'ny halalin'ny fluid surface (ASL).Izy io koa dia manimba ny fahafahan'ny rafi-pitaterana mucociliary (MCT) hanadio ny lalan-drivotra amin'ny poti-pofona sy otrikaretina.Ny tanjonay dia ny hamolavola fitsaboana fototarazo lentiviral (LV) hanaterana ny dika mitovy amin'ny fototarazo CFTR sy hanatsara ny fahasalaman'ny ASL, MCT, ary havokavoka, ary hanohy ny famolavolana teknolojia vaovao afaka mandrefy ireo mari-pamantarana ireo amin'ny vivo1.
Ny vectors LV dia iray amin'ireo kandidà lehibe indrindra amin'ny fitsaboana fototarazo cystic fibrosis, indrindra satria izy ireo dia afaka mampiditra maharitra ny fototarazo fitsaboana amin'ny sela basal lalan-drivotra (selan'ny rivotra).Zava-dehibe izany satria afaka mamerina ny hydration ara-dalàna sy ny fanadiovana ny mucus amin'ny alàlan'ny fanavahana azy ireo amin'ny sela eny ambonin'ny lalan-drivotra voahitsy fototarazo mifandray amin'ny cystic fibrosis, ka miteraka tombontsoa mandritra ny androm-piainana.Ny vector LV dia tsy maintsy ampitaina amin'ny lalan-drivotra conductive, satria eo no manomboka ny fidiran'ny havokavoka amin'ny CF.Ny fandefasana ilay vector lalindalina kokoa any amin'ny havokavoka dia mety hiteraka transduction alveolar, saingy tsy misy fiantraikany amin'ny fitsaboana amin'ny cystic fibrosis izany.Na izany aza, ny ranon-javatra toy ny mpitatitra fototarazo dia mifindra ho any amin'ny alveoli rehefa mifoka aorian'ny fiterahana3,4 ary ireo singa ara-pahasalamana dia alefa haingana ao amin'ny vavan'ny MCTs.Ny fahombiazan'ny transduction LV dia mifandray mivantana amin'ny halavan'ny fotoana hijanonan'ny vector eo akaikin'ny sela kendrena mba hahafahan'ny cellule uptake - "fotoana fonenana" 5 izay mora nohafohezina amin'ny fikorianan'ny rivotra mahazatra eo amin'ny faritra ary koa ny fampifanarahana ny mucus sy ny MCT.Ho an'ny cystic fibrosis, ny fahafahana manalava ny fotoana ipetrahan'ny LV ao amin'ny lalan-drivotra dia zava-dehibe mba hahatratrarana ambaratonga avo lenta amin'ity faritra ity, saingy sarotra hatreto.
Mba handresena an'io sakana io dia manolotra soso-kevitra izahay fa afaka manampy amin'ny fomba roa mifameno ny LV magnetic particles (MPs).Voalohany, azo tarihin'ny andriamby mankany amin'ny lalan-drivotra izy ireo mba hanatsarana ny tanjona ary hanampy ireo poti-pitaterana fototarazo ho eo amin'ny faritra havanana amin'ny lalan-drivotra;ary ASL) dia miditra amin'ny sosona sela 6. Ny solombavambahoaka dia ampiasaina betsaka ho toy ny fiara fitaterana zava-mahadomelina lasibatra rehefa mifatotra amin'ny antibiôsy, fanafody chimiothérapie, na molekiola kely hafa izay miraikitra amin'ny fonon'ny sela na mifatotra amin'ny mpandray ny sela misy azy ireo ary miangona any amin'ny toerana misy ny tumor. fisian'ny herinaratra static.Sahan'andriamby ho an'ny fitsaboana homamiadana 7. Ny fomba hafa "hyperthermique" dia mikendry ny hamono ny sela fivontosana amin'ny alàlan'ny fanafanana ny solombavambahoaka rehefa tratran'ny sahan'andriamby mihetsiketsika.Ny fitsipiky ny fifindran'ny magnetika, izay ampiasaina ny sahan'andriamby ho toy ny fitaovana fampitaovana hanatsarana ny fifindrana ny ADN ao anaty sela, dia matetika ampiasaina amin'ny vitro amin'ny fampiasana karazana fototarazo tsy virtoaly sy viriosy ho an'ny tsipika sela sarotra. ..Ny fahombiazan'ny LV magnetotransfection miaraka amin'ny fandefasana LV MP in vitro ao amin'ny tsipika sela amin'ny epithélium bronchial olombelona eo anatrehan'ny sahan'andriamby static dia naorina, mampitombo ny fahombiazan'ny transduction amin'ny in-186 raha oharina amin'ny vector LV irery.Ny LV MT koa dia nampiharina tamin'ny modely in vitro amin'ny cystic fibrosis, izay nampitomboan'ny transfection magnetika ny transduction LV amin'ny kolontsaina interface tsara amin'ny rivotra amin'ny 20 amin'ny fisian'ny cystic fibrosis sputum10.Na izany aza, ny magnetotransfection taova ao amin'ny vivo dia nahazo fiheverana kely ary nodinihina tamin'ny fandalinana biby vitsivitsy11,12,13,14,15, indrindra fa ao amin'ny havokavoka16,17.Na izany aza, mazava tsara ny mety hisian'ny fifindran'ny magnetika amin'ny fitsaboana ny havokavoka amin'ny cystic fibrosis.Tan et al.(2020) dia nilaza fa "ny fandalinana fanamarinana momba ny fandefasana havokavoka mahomby amin'ny nanoparticles magnetika dia hanokatra ny lalana ho an'ny paikadin'ny inhalation CFTR amin'ny ho avy hanatsarana ny vokatra klinika amin'ny marary voan'ny cystic fibrosis"6.
Sarotra ny mijery sy mianatra ny fitondran-tenan'ny singa magnetika kely eny ambonin'ny taovam-pisefoana eo anatrehan'ny sahan'andriamby ampiharina, ary noho izany dia tsy takatry ny saina.Ao amin'ny fandalinana hafa, dia namolavola fomba amam-panao Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) ho an'ny sary tsy misy invasive sy fampitomboana ny fiovan'ny vivo minitra amin'ny halalin'ny ASL18 sy ny fitondran-tena MCT19,20 mba handrefesana mivantana ny hydration entona entona. ary ampiasaina ho famantarana ny fahombiazan'ny fitsaboana aloha.Ho fanampin'izany, ny fomba fanamarihan'ny MCT antsika dia mampiasa poti-tsava 10-35 µm misy alumina na vera fanondroana refractive avo toy ny marika MCT hita amin'ny PB-PCXI21.Ireo fomba roa ireo dia mety amin'ny fanaovana sary karazana karazana singa, anisan'izany ny MP.
Noho ny fanapahan-kevitra avo lenta sy ara-nofo, ny ASL sy MCT miorina amin'ny PB-PCXI dia mifanentana tsara amin'ny fandalinana ny dinamika sy ny fitondran-tena amin'ny singa tokana sy ampahany amin'ny vivo mba hanampiana antsika hahatakatra sy hanatsara ny fomba fandefasana fototarazo MP.Ny fomba ampiasantsika eto dia mifototra amin'ny fianaranay mampiasa ny SPring-8 BL20B2 beamline, izay nahitanay ny fihetsehan'ny ranon-javatra taorian'ny fandefasana dosie vector dummy ao amin'ny lalan-drivotry ny orona sy ny havokavoka mba hanampy amin'ny fanazavana ny fomba fanehoana ny fototarazo heterogène. amin'ny fototarazontsika.fianarana biby miaraka amin'ny fatran'ny carrier 3.4.
Ny tanjon'ity fanadihadiana ity dia ny fampiasana ny PB-PCXI synchrotron mba hijerena ny fihetsiketsehan'ny solombavambahoaka maromaro ao anaty trachea misy voalavo velona.Ireo fandalinana sary PB-PCXI ireo dia natao hitsapana ny andiany MP, ny tanjaky ny sahan'andriamby, ary ny toerana hamaritana ny fiantraikany amin'ny hetsika MP.Noheverinay fa ny sahan'andriamby ivelany dia hanampy ny MF naterina na hifindra any amin'ny faritra kendrena.Ireo fanadihadiana ireo ihany koa dia namela anay hamantatra ny firafitry ny andriamby izay mampitombo ny habetsaky ny singa tavela ao amin'ny trachea aorian'ny fametrahana azy.Ao amin'ny andiana fanadihadiana faharoa, dia nikendry ny hampiasa ity fikandrana tsara indrindra ity izahay mba hanehoana ny lamina transduction vokatry ny fandefasana in vivo ny LV-MPs mankany amin'ny lalan-drivotra voalavo, amin'ny fiheverana fa ny fandefasana LV-MP amin'ny tontolon'ny fikajiana ny lalan-drivotra dia miteraka. amin'ny fampitomboana ny fahombiazan'ny transduction LV..
Ny fianarana biby rehetra dia natao araka ny protocoles nankatoavin'ny University of Adelaide (M-2019-060 sy M-2020-022) ary ny SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Ny andrana dia natao araka ny tolo-kevitry ny ARRIVE.
Ny sary x-ray rehetra dia nalaina tao amin'ny beamline BL20XU tao amin'ny synchrotron SPring-8 any Japana tamin'ny fampiasana setup mitovy amin'ny voalaza teo aloha21,22.Raha fohifohy, dia 245 m avy amin'ny peratra fitehirizana synchrotron no nisy ilay boaty andrana.Ny halaviran'ny santionany amin'ny mpitsikilo 0,6 m dia ampiasaina amin'ny fandalinana sary momba ny singa ary 0,3 m ho an'ny fandalinana sary in vivo mba hamoronana fiantraikany mifanohitra amin'ny dingana.Taratra monochromatic manana angovo 25 keV no nampiasaina.Ny sary dia azo tamin'ny alàlan'ny transducer X-ray avo lenta (SPring-8 BM3) miaraka amin'ny detector sCMOS.Ny transducer dia mamadika taratra X ho hazavana hita maso amin'ny alàlan'ny scintillator matevina 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), izay avy eo dia tarihina amin'ny sensor sCMOS amin'ny alàlan'ny tanjona mikroskopika × 10 (NA 0.3).Ny mpitsikilo sCMOS dia Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japana) manana habe 2048 × 2048 teboka ary habe manta 6.5 × 6.5 µm.Ity toe-javatra ity dia manome haben'ny piksel isotropika mahomby amin'ny 0,51 µm ary sahan'ny fijery manodidina ny 1,1 mm × 1,1 mm.Ny faharetan'ny fampahafantarana 100 ms dia nofantenana mba hanamafisana ny tahan'ny signal-to-noise amin'ny singa magnetika ao anatiny sy ivelan'ny lalan-drivotra ary manamaivana ny artifact mihetsika vokatry ny fofonaina.Ho an'ny fandalinana ao amin'ny vivo, nisy fanakatonana X-ray haingana napetraka teo amin'ny lalana X-ray mba hamerana ny fatran'ny taratra amin'ny fanakanana ny taratra X-ray eo anelanelan'ny fampiratiana.
Ny fampahalalam-baovao LV dia tsy nampiasaina tamin'ny fandalinana sary SPring-8 PB-PCXI satria ny efitrano fanaovana sary BL20XU dia tsy voamarina Biosafety Level 2.Fa kosa, nisafidy karazana solombavambahoaka voafaritra tsara izahay avy amin'ireo mpivarotra ara-barotra roa mirakitra isan-karazany ny habeny, ny fitaovana, ny fifantohana amin'ny vy, ary ny fampiharana , - voalohany mba hahatakarana ny fiantraikan'ny sahan'andriamby amin'ny fihetsiky ny solombavambahoaka amin'ny capillaries fitaratra, ary avy eo amin'ny lalan-drivotra velona.surface.Ny haben'ny MP dia miovaova amin'ny 0,25 ka hatramin'ny 18 µm ary vita amin'ny fitaovana isan-karazany (jereo ny tabilao 1), saingy tsy fantatra ny firafitry ny santionany tsirairay, anisan'izany ny haben'ny singa magnetika ao amin'ny MP.Miorina amin'ny fandalinana MCT 19, 20, 21, 23, 24, manantena izahay fa ny solombavambahoaka midina hatramin'ny 5 µm dia azo jerena eo amin'ny lalan-drivotra tracheal, ohatra, amin'ny alàlan'ny fanalana ny frame misesy mba hahitana ny fahitana ny hetsika MP.Ny MP tokana amin'ny 0.25 µm dia kely kokoa noho ny famahana ny fitaovana fanaovana sary, fa ny PB-PCXI dia andrasana hahita ny fifanoheran'izy ireo amin'ny volumetric sy ny fihetsehan'ny ranon-tany izay ametrahana azy ireo aorian'ny fametrahana azy.
Santionany isaky ny MP eo amin'ny latabatra.1 dia nomanina tamin'ny capillaries vera 20 μl (Drummond Microcaps, PA, Etazonia) miaraka amin'ny savaivony anatiny 0,63 mm.Ny singa corpuscular dia misy ao anaty rano, raha ny singa CombiMag kosa dia azo alaina ao amin'ny ranon'ny mpanamboatra.Ny fantsona tsirairay dia feno ranon-javatra antsasany (eo amin'ny 11 µl) ary apetraka eo amin'ny fitoeran'ny santionany (jereo ny sary 1).Ny capillaries fitaratra dia napetraka mitsivalana eo amin'ny lampihazo ao amin'ny efitrano fanaovana sary, tsirairay avy, ary napetraka eo amin'ny sisin'ny ranon-javatra.19 mm savaivony (28 mm lava) andriamby akorandriaka nikela vita amin'ny tany tsy fahita firy, neodymium, vy sy boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) miaraka amin'ny 1.17 T sisa tavela amin'ny iray. latabatra famindrana misaraka mba hahatratrarana Ovay lavitra ny toeranao mandritra ny fanaovana.Ny sary X-ray dia manomboka rehefa mipetraka eo amin'ny 30 mm eo ambonin'ny santionany ny andriamby ary mahazo sary amin'ny sary 4 isan-tsegondra.Nandritra ny fakana sary, ny andriamby dia nanakaiky ny fitaratra capillary fantsona (eo amin'ny halavirana tokony ho 1 mm) ary avy eo dia nifindra nanaraka ny fantsona mba hanombanana ny vokatry ny saha tanjaky ny toerana.
Fanamboarana sary in vitro misy santionany MP ao anaty kapila fitaratra amin'ny dingan'ny fandikana ny santionany xy.Ny lalan'ny taratra X-ray dia voamarika amin'ny tsipika mena.
Raha vantany vao tafapetraka ny fahitan'ny solombavambahoaka in vitro, ny ampahany amin'izy ireo dia nosedraina in vivo tamin'ny voalavo Wistar albino vavy (~ 12 herinandro, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japana) ary butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Notsaboina tamin'ny fangaro Pharma (Japon) tamin'ny alalan'ny tsindrona intraperitoneal ny voalavo.Taorian'ny fanatoranana, dia nomanina ho amin'ny sary izy ireo amin'ny fanesorana ny volony manodidina ny trachea, ny fampidirana fantsona endotracheal (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), ary tsy mihetsika eo amin'ny toerana mitsangana eo amin'ny takelaka fakan-tsary natao manokana misy kitapo mafana. mba hitazonana ny hafanan’ny vatana.22. Avy eo dia napetaka tamin'ny dingana santionany tao amin'ny boaty fanaovana sary tamin'ny zoro kely ny takelaka fanaovana sary mba hampifanaraka ny trachea mitsivalana eo amin'ny sary x-ray araka ny aseho amin'ny sary 2a.
(a) Fametrahana sary ao amin'ny vivo ao amin'ny vondrona mpaka sary SPring-8, lalan'ny taratra X-ray voamarika misy tsipika mena.(b, c) Ny localization magnet tracheal dia natao lavitra tamin'ny fampiasana fakantsary IP roa napetraka orthogonally.Eo amin'ny ilany havia amin'ny sary eo amin'ny efijery dia hitanao ny tadim-tariby mitazona ny lohany sy ny cannula fanaterana napetraka ao anatin'ny fantsona ET.
Ny rafitra paompy syringe voafehy lavitra (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mampiasa syringe vera 100 µl dia mifandray amin'ny fantsona PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) mampiasa fanjaitra 30 Ga.Mariho ny fantsona mba hahazoana antoka fa ny tendrony dia eo amin'ny toerana mety ao amin'ny trachea rehefa mampiditra ny endotracheal tube.Amin'ny fampiasana micropump dia nesorina ny plunger syringe ary natsofoka tao amin'ny santionany MP ny tendron'ny fantsona.Ny fantsona fanaterana entana dia nampidirina tao amin'ny fantsona endotracheal avy eo, nametraka ny tendrony amin'ny faritra matanjaka indrindra amin'ny sahan'andriamby andrasana.Ny fakana sary dia nofehezina tamin'ny alàlan'ny mpitsikilo fofonaina mifandray amin'ny boaty fanaon'ny Arduino, ary ny famantarana rehetra (ohatra, ny mari-pana, ny respiration, ny fanakatonana misokatra / mihidy, ary ny fahazoana sary) dia voarakitra amin'ny alàlan'ny Powerlab sy LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) Rehefa tsy misy ny trano dia misy fakantsary IP roa (Panasonic BB-SC382) napetraka eo amin'ny 90 ° eo ho eo ary ampiasaina hifehy ny toeran'ny andriamby mifandraika amin'ny trachea mandritra ny fakana sary (sary 2b, c).Mba hanamaivanana ny artifact mihetsika, sary iray isaky ny fofonaina no nalaina nandritra ny lembalemba fikorianan'ny taovam-pisefoana farany.
Ny andriamby dia mifamatotra amin'ny dingana faharoa, izay mety ho hita lavitra eo ivelan'ny vatan'ny sary.Nosedraina ny toerana sy ny fandrindrana ny andriamby isan-karazany, ao anatin'izany ny: napetraka amin'ny zoro 30° eo ho eo ambonin'ny trachea (aseho ao amin'ny sary 2a sy 3a) ny fanamafisana;ny andriamby iray eo ambonin'ny biby ary ny iray eo ambany, miaraka amin'ny bao natao hisarihana (sary 3b)., andriamby iray eo ambonin'ny biby ary ny iray eo ambany, miaraka amin'ny bao natao handroahana (sary 3c), ary andriamby iray eo ambony ary mijoro tsara amin'ny trachea (sary 3d).Aorian'ny fametrahana ny biby sy ny andriamby ary ny fampidirana ny MP eo am-panandramana ao amin'ny paompy syringe, dia atero fatra 50 µl amin'ny tahan'ny 4 µl/sec rehefa nahazo sary.Ny andriamby avy eo dia ahetsiketsika mandroso sy miverina manaraka na mamakivaky ny trachea raha mbola manohy maka sary.
Fikirakirana andriamby ho an'ny sary in vivo (a) andriamby iray eo ambonin'ny trachea amin'ny zoro 30° eo ho eo, (b) andriamby roa namboarina mba hisarihana, (c) andriamby roa namboarina mba handroahana, (d) andriamby iray eo amboniny ary mifanandrify amin'ny trachea.Ny mpandinika dia nijery avy eo amin'ny vava mankany amin'ny havokavoka amin'ny alàlan'ny trachea ary ny taratra X-ray dia nandalo ny ilany havian'ny voalavo ary nivoaka ny ilany havanana.Ny andriamby dia na mihetsika amin'ny halavan'ny lalan-drivotra na miankavia sy miankavanana eo ambonin'ny trachea mankany amin'ny taratra X-ray.
Niezaka ihany koa izahay hamantatra ny fahitana sy ny fitondran-tenan'ireo singa ao amin'ny lalan-drivotra raha tsy misy fifangaroana ny respiration sy ny fitepon'ny fo.Noho izany, tamin'ny fiafaran'ny vanim-potoanan'ny sary, ny biby dia nodiovina tamin'ny maha-olombelona noho ny overdose pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, Etazonia; ~ 65 mg / kg ip).Ny biby sasany dia tavela teo amin'ny sehatra fanaovana sary, ary taorian'ny nitsaharan'ny fofonaina sy ny fitempon'ny fo, dia naverina ny fizotry ny sary, nampiana fatra MP fanampiny raha tsy nisy MP hita teo amin'ny sisin'ny lalan-drivotra.
Nahitsy ho an'ny saha fisaka sy maizina ireo sary vokarina ary avy eo natambatra ho sarimihetsika (sary 20 isan-tsegondra; 15–25 × hafainganam-pandeha mahazatra miankina amin'ny taham-pisefoana) amin'ny alàlan'ny script manokana nosoratana tamin'ny MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ny fianarana rehetra momba ny fandefasana virosy LV dia natao tao amin'ny University of Adelaide Laboratory Animal Research Center ary mikendry ny hampiasa ny valin'ny fanandramana SPring-8 mba hanombanana raha mety hampitombo ny famindrana ny fototarazo amin'ny vivo ny fandefasana LV-MP amin'ny fisian'ny sahan'andriamby. .Mba hanombanana ny fiantraikan'ny MF sy ny sahan'andriamby, dia vondrona biby roa no notsaboina: ny vondrona iray dia nampidirina tamin'ny LV MF miaraka amin'ny fametrahana andriamby, ary ny vondrona iray hafa dia natsindrona vondrona mpanara-maso miaraka amin'ny LV MF tsy misy andriamby.
Ny vectors général LV dia novolavolaina tamin'ny fomba voalaza teo aloha 25, 26.Ny véctor LacZ dia maneho fototarazo beta-galactosidase nokleary eo an-toerana tarihin'ny MPSV constitutive promoter (LV-LacZ), izay mamokatra vokatra manga amin'ny sela nafindra, hita eo amin'ny anoloana sy ny ampahany amin'ny tavy havokavoka.Ny titration dia natao tamin'ny kolontsaina sela amin'ny fanisana tanana ny isan'ny sela LacZ-positive amin'ny fampiasana hemocytometer mba hanombanana ny titer amin'ny TU / ml.Ny mpitatitra dia voatahiry amin'ny -80 ° C, alevina alohan'ny hampiasana, ary mifamatotra amin'ny CombiMag amin'ny fampifangaroana 1: 1 ary asiana ranomandry mandritra ny 30 minitra farafahakeliny alohan'ny hanaterana.
Voalavo Sprague Dawley mahazatra (n = 3 / vondrona, ~ 2-3 ip anesthetized miaraka amin'ny fifangaroan'ny 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ary 60mg / kg ketamine (Ilium, Australia) amin'ny 1 volana) ip ) tsindrona sy tsindrona am-bava tsy fandidiana miaraka amin'ny cannula intravenous 16 Ga.Mba hahazoana antoka fa ny tadin'ny tracheal dia mahazo transduction LV, dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny protocol perturbation mekanika efa voalaza teo aloha izay nokosehana axial ny lalan-drivotra tracheal miaraka amin'ny harona tariby (N-Circle, mpitrandraka vato nitinol tsy misy tendrony NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Etazonia) 30 p28.Avy eo, tokony ho 10 minitra taorian'ny fikorontanana tao amin'ny kabinetra biosafety dia natao ny fitantanana tracheal LV-MP.
Ny sahan'andriamby ampiasaina amin'ity andrana ity dia namboarina mitovy amin'ny fandalinana x-ray in vivo, miaraka amin'ny andriamby mitovy amin'ny trachea miaraka amin'ny clamps stent distillation (sary 4).Volana 50 µl (2 x 25 µl aliquots) an'ny LV-MP dia naterina tany amin'ny trachea (n = biby 3) tamin'ny alalan'ny pipette misy gel araka ny voalaza teo aloha.Ny vondrona mpanara-maso (n = biby 3) dia nahazo LV-MP mitovy tsy misy fampiasana andriamby.Rehefa vita ny fampidirana dia esorina amin'ny fantsona endotracheal ny cannula ary esorina ilay biby.Mijanona eo amin'ny toerany mandritra ny 10 minitra ny andriamby alohan'ny hanesorana azy.Ny voalavo dia nalaina tamin'ny meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) narahin'ny fanalana anesthesia amin'ny alàlan'ny tsindrona intraperitoneal 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Nafanaina ny voalavo ary nojerena mandra-pahasitrana tanteraka tamin'ny fanatoranana.
Fitaovana fanaterana LV-MP ao anaty kabinetra fiarovana biolojika.Hitanao fa mipoitra avy amin'ny vava ny sakan'ny Luer-lock maitso maitso amin'ny fantsona ET, ary ny tendron'ny pipette gel aseho amin'ny sary dia ampidirina amin'ny alàlan'ny fantsona ET mankany amin'ny halalin'ny trachea.
Herinandro taorian'ny fomba fitantanan'ny LV-MP dia natao sorona olombelona ny biby tamin'ny alalan'ny inhalation 100% CO2 ary ny fanehoana LacZ dia nodinihina tamin'ny fampiasana ny fitsaboana X-gal mahazatra.Ny peratra cartilage telo be indrindra dia nesorina mba hahazoana antoka fa tsy ho tafiditra ao anatin'ny fanadihadiana ny fahasimbana mekanika na ny fihazonana ny fluid noho ny fametrahana fantsona endotracheal.Ny trachea tsirairay dia notapatapahana mba hahazoana antsasany roa hanaovana fanadihadiana ary napetraka ao anaty kaopy misy fingotra silicone (Sylgard, Dow Inc) amin'ny fampiasana fanjaitra Minutien (Fine Science Tools) mba hijerena ny endriky ny luminal.Ny fizarana sy ny toetran'ireo sela navadika dia nohamafisin'ny sary eo anoloana amin'ny fampiasana mikraoskaopy Nikon (SMZ1500) miaraka amin'ny fakan-tsary DigiLite sy rindrambaiko TCapture (Tucsen Photonics, Shina).Ny sary dia azo tamin'ny fampitomboana 20x (anisan'izany ny toerana ambony indrindra ho an'ny sakany feno amin'ny trachea), miaraka amin'ny halavan'ny trachea manontolo naseho tsikelikely, manome fifanoherana ampy eo amin'ny sary tsirairay mba ahafahan'ny sary "manjaitra".Ny sary avy amin'ny trachea tsirairay dia natambatra ho sary mitambatra tokana amin'ny alàlan'ny Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) amin'ny alàlan'ny algorithm planar motion. Ny faritry ny fitenenana LacZ ao anatin'ny sarin'ny tracheal composite avy amin'ny biby tsirairay dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny script MATLAB mandeha ho azy (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha28, amin'ny fampiasana fikandrana 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ary Value <0.7. Ny faritry ny fitenenana LacZ ao anatin'ny sary mitambatra tracheal avy amin'ny biby tsirairay dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny script MATLAB mandeha ho azy (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha28, amin'ny fampiasana fika 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ary Value <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Ny faritry ny fanehoana LacZ amin'ny sarin'ny tracheal composite avy amin'ny biby tsirairay dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny script MATLAB mandeha ho azy (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha28 amin'ny alàlan'ny fikandrana 0.350.15 ary sanda <0.7.如 前所 述, 使用 自动 Matlab 脚本 (R2020AA, Mathworks) 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 中 lacz 表达 区域 进行 量化, ​​使用 0.35 <色调 <0.58, 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的 设置.如如 述, 自动 Matlab 脚本 ((R2020AA, Mathworks) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化, 使用 使用 量化, 使用 使用 量化, 使用 使用 量化 0.35 <0,58,> 0.15 和值 <0.7 和值 ..... .. . . . . . . . . . HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Ny faritry ny fanehoana LacZ amin'ny sary mitambatra ny trachea ny biby tsirairay dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny script MATLAB mandeha ho azy (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha tamin'ny fampiasana fika 0.35 < hue <0.58, saturation> 0.15 ary sanda <0.7.Amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fisehon'ny sela ao amin'ny GIMP v2.10.24, dia nisy saron-tava noforonina ho an'ny sary mitambatra tsirairay mba hamantarana ny faritry ny tavy ary hisorohana ny fisavana diso ivelan'ny tadin'ny tracheal.Ny faritra voaloto avy amin'ny sary mitambatra rehetra avy amin'ny biby tsirairay dia nofinofy mba hanomezana ny totalin'ny faritra voaloto ho an'io biby io.Ny faritra voaloko dia nozaraina tamin'ny totalin'ny saron-tava mba hahazoana faritra mahazatra.
Ny trachea tsirairay dia napetraka ao anaty paraffin ary nozaraina 5 µm matevina.Ny fizarana dia nofafana tamin'ny mena haingana tsy miandany nandritra ny 5 minitra ary nahazo sary tamin'ny alàlan'ny mikraoskaopy Nikon Eclipse E400, fakan-tsary DS-Fi3 ary rindrambaiko fisamborana singa NIS (version 5.20.00).
Ny famakafakana statistika rehetra dia natao tao amin'ny GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Ny lanjan'ny statistika dia napetraka amin'ny p ≤ 0.05.Ny mahazatra dia nosedraina tamin'ny alàlan'ny fitsapana Shapiro-Wilk ary ny fahasamihafana amin'ny fandokoana LacZ dia nodinihina tamin'ny fampiasana t-test tsy misy dikany.
Ireo solombavambahoaka enina voalaza ao amin'ny tabilao 1 dia nodinihin'ny PCXI, ary ny fahitana dia voalaza ao amin'ny tabilao 2. Solombavambahoaka polystyrene roa (MP1 sy MP2; 18 µm ary 0.25 µm, tsirairay avy) dia tsy hitan'ny PCXI, fa ny santionany sisa dia azo fantarina. (ohatra dia aseho amin'ny sary 5).MP3 sy MP4 dia tsy hita maso (10-15% Fe3O4; 0.25 µm ary 0.9 µm, tsirairay avy).Na dia MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) aza dia nahitana ny ampahany kely indrindra notsapaina, dia io no tena voatonona indrindra.Sarotra ny manavaka ny vokatra CombiMag MP6.Amin'ny toe-javatra rehetra, ny fahafahantsika mamantatra ny MF dia nohatsaraina be tamin'ny alàlan'ny fampandehanana ny andriamby miverina sy miverina mifanandrify amin'ny kapila.Rehefa niala tamin'ny capillary ny andriamby, dia nosintonina tao anaty rojo lava ny andriamby, fa rehefa nanatona ny andriamby ary nitombo ny tanjaky ny sahan'andriamby, dia nihafohy ny rojo vy rehefa nifindra tany amin'ny faritra ambony amin'ny kapila ireo singa (jereo ny Video fanampiny S1 : MP4), mampitombo ny hakitroky ny poti eny ambonin'ny.Mifanohitra amin'izany kosa, rehefa esorina amin'ny kapilary ny andriamby, dia mihena ny tanjaky ny saha ary ny solombavambahoaka dia mandamina ho rojo lava lava manomboka eo amin'ny tendrony ambony amin'ny kapila (jereo ny Video fanampiny S2: MP4).Rehefa tsy mihetsiketsika intsony ny andriamby, dia manohy mihetsika mandritra ny fotoana kelikely ny poti rehefa tonga eo amin'ny toeran'ny equilibrium.Rehefa mandroso mankany amin'ny faritra ambony amin'ny kapilara ny MP, dia mirona hisintona poti-javatra amin'ny ranon-javatra ireo poti-magnetika.
Ny fahitana ny MP eo ambanin'ny PCXI dia miovaova be eo amin'ny santionany.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ary (d) MP6.Ny sary rehetra aseho eto dia nalaina tamin'ny andriamby napetraka eo amin'ny 10 mm eo ambonin'ny kapila.Ny faribolana lehibe miharihary dia miboiboika rivotra voafandrika ao amin'ny capillaries, mampiseho mazava tsara ny endriky ny sisiny mainty sy fotsy amin'ny sary mifanohitra amin'ny dingana.Ny boaty mena dia manondro ny fampitomboana izay manatsara ny fifanoherana.Mariho fa ny savaivony amin'ny fizaran-tany andriamby amin'ny tarehimarika rehetra dia tsy mitovy amin'ny habeny ary eo ho eo amin'ny 100 heny noho ny aseho.
Rehefa mihetsika miankavia sy miankavanana eo an-tampon'ny kapila ny andriamby, dia miova ny zoro amin'ny tady MP mba hifanaraka amin'ny andriamby (jereo ny sary 6), ka mamaritra ny tsipika sahan'andriamby.Ho an'ny MP3-5, rehefa tonga eo amin'ny zoro tokonam-baravarana ny chord, dia misintona eny amin'ny tendrony ambony amin'ny capillary ireo singa.Matetika izany no mahatonga ny solombavambahoaka mivondrona ho vondrona lehibe kokoa eo akaikin'ny sahan'andriamby matanjaka indrindra (jereo ny horonan-tsary fanampiny S3: MP5).Miharihary indrindra koa izany rehefa maka sary akaikin'ny faran'ny kapilara, izay mahatonga ny MP hitambatra sy hifantoka amin'ny fifandraisana amin'ny rivotra.Ny singa ao amin'ny MP6, izay sarotra kokoa ny manavaka azy noho ny ao amin'ny MP3-5, dia tsy nitaritarika rehefa nandeha ny andriamby teo amin'ny capillary, fa ny tadin'ny MP dia nisaraka, ka namela ireo singa hita maso (jereo ny Video fanampiny S4: MP6).Amin'ny toe-javatra sasany, rehefa nihena ny sahan'andriamby nampiharina tamin'ny alalan'ny fihetsehana ny andriamby lavitr'ezaka avy amin'ny toerana fanaovana sary, ny solombavambahoaka sisa tavela dia nidina tsikelikely ho any amin'ny faran'ny fantsona amin'ny alàlan'ny gravité, mijanona ao amin'ny tady (jereo ny horonan-tsary fanampiny S5: MP3). .
Miova ny zoro amin'ny tady MP rehefa mihetsika miankavanana eo ambonin'ny capillary ny andriamby.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ary (d) MP6.Ny boaty mena dia manondro ny fampitomboana izay manatsara ny fifanoherana.Azafady, mariho fa ny horonan-tsary fanampiny dia natao ho an'ny fampahafantarana satria manambara firafitry ny singa manan-danja sy fampahalalana mavitrika izay tsy azo jerena ao amin'ireo sary static ireo.
Nasehon'ny fitsapana nataonay fa ny fampihetsiketsehana ny andriamby miverina sy miverina miadana eo amin'ny trachea dia manamora ny fahitana ny MF amin'ny tontolon'ny hetsika sarotra in vivo.Tsy nisy fitsapana in vivo natao satria ny vakana polystyrene (MP1 sy MP2) dia tsy hita tao amin'ny kapila.Ny tsirairay amin'ireo MF efatra ambiny dia nosedraina in vivo miaraka amin'ny axis lavan'ny andriamby napetraka eo ambonin'ny trachea amin'ny zoro tokony ho 30 ° amin'ny mitsangana (jereo ny sary 2b sy 3a), satria niteraka rojo MF lava kokoa izany ary nahomby kokoa. noho ny andriamby..tapitra ny configuration.MP3, MP4 ary MP6 dia tsy hita tao amin'ny trachea misy biby velona.Rehefa jerena ny taovam-pisefoan'ny voalavo taorian'ny namonoan'ny olombelona ny biby, dia nijanona tsy hita maso ireo poti-javatra na dia nampiana boky fanampiny aza tamin'ny fampiasana paompy syringe.Ny MP5 dia manana votoaty oksizenina vy avo indrindra ary izy no hany singa hita maso, noho izany dia nampiasaina hanombanana sy hamaritana ny fitondran-tena MP ao amin'ny vivo.
Ny fametrahana ny andriamby eo ambonin'ny trachea nandritra ny fampidirana MF dia niteraka maro, fa tsy ny rehetra, nifantoka tamin'ny sehatry ny fijery.Ny fidiran'ny poti-tsolika ao amin'ny trachea dia tsara indrindra hojerena amin'ny biby voahodidin'ny olombelona.Sary 7 sy horonan-tsary fanampiny S6: MP5 dia mampiseho ny fisamborana andriamby haingana sy ny fampifanarahana ny poti-javatra eo amin'ny faritry ny trachea ventral, izay manondro fa ny solombavambahoaka dia azo lasibatra amin'ny faritra tiana amin'ny trachea.Rehefa mikaroka lavitra kokoa amin'ny trachea aorian'ny fanaterana MF, dia hita akaiky kokoa ny carina ny MF sasany, izay manondro ny tsy fahampian'ny herin'ny sahan'andriamby mba hanangonana sy hitazonana ny MF rehetra, satria naterina tamin'ny faritra manana tanjaky ny sahan'andriamby ambony indrindra izy ireo nandritra ny fitantanana rano.dingana.Na izany aza, ny fatran'ny MP postnatal dia ambony kokoa nanodidina ny faritry ny sary, izay nanoro hevitra fa maro ireo solombavambahoaka no nijanona tany amin'ny faritry ny lalan-drivotra izay nahitana ny tanjaky ny sahan'andriamby ambony indrindra.
Sarin'ny (a) alohan'ny sy (b) aorian'ny fandefasana MP5 ao anaty trachea misy voalavo voalavo vao haingana miaraka amin'ny andriamby napetraka eo ambonin'ny faritra fanaovana sary.Ny faritra aseho dia eo anelanelan'ny peratra cartilaginous roa.Misy tsiranoka amin'ny lalan-drivotra alohan'ny hanaterana ny MP.Ny boaty mena dia manondro ny fampitomboana izay manatsara ny fifanoherana.Ireo sary ireo dia nalaina tamin'ny lahatsary nasongadina tao amin'ny S6: Video Fanampiny MP5.
Ny fifindran'ny andriamby eo amin'ny trachea in vivo dia niteraka fiovana eo amin'ny zoro ny rojo MP eo amin'ny lalan-drivotra, mitovy amin'ny hita ao amin'ny capillaries (jereo ny sary 8 sy ny Video fanampiny S7: MP5).Na izany aza, tamin'ny fandinihanay, ny solombavambahoaka dia tsy azo notaritina teny amin'ny tontolon'ny taovam-pisefoana velona, ​​toy ny ataon'ny capillaries.Amin'ny toe-javatra sasany, mihalava ny rojo MP rehefa mihetsika miankavia sy miankavanana ny andriamby.Mahaliana fa hitanay ihany koa fa manova ny halalin'ny sosona ambonin'ny ranon-javatra ny rojo vy rehefa mihetsika lavidavitra eo amin'ny trachea ny andriamby, ary mivelatra rehefa mihetsika mivantana eo ambonin'ny lohany ilay andriamby ary mihodina mankany amin'ny toerana mitsangana ny rojo vy (jereo Video fanampiny S7).: MP5 amin'ny 0:09, ambany havanana).Niova ny fomba fihetsehan'ny toetra mampiavaka azy rehefa nahetsiketsika an-tsisin'ny tampon'ny trachea ny andriamby (izany hoe, miankavia na havanana amin'ny biby, fa tsy manaraka ny halavan'ny trachea).Mbola tazana mazava tsara ireo poti-javatra nandritra ny fihetsehan’izy ireo, fa rehefa nesorina tao amin’ny trachea ilay andriamby dia hita taratra ny tendron’ireo tadin-tsolika (jereo ny horonan-tsary fanampiny S8: MP5, manomboka amin’ny 0:08).Izany dia mifanaraka amin'ny fitondran-tena voamariky ny sahan'andriamby eo ambanin'ny asan'ny sahan'andriamby ampiharina amin'ny kapila fitaratra.
Sary santionany mampiseho MP5 ao amin'ny trachea amin'ny voalavo anesthetized velona.(a) Ny andriamby dia ampiasaina mba hahazoana sary etsy ambony sy eo ankavian'ny trachea, avy eo (b) rehefa avy namindra ny andriamby miankavanana.Ny boaty mena dia manondro ny fampitomboana izay manatsara ny fifanoherana.Ireo sary ireo dia avy amin'ny lahatsary nasongadina tao amin'ny Lahatsary Fanampiny S7: MP5.
Rehefa nifandona tamin'ny orientation avaratra-atsimo ambony sy ambanin'ny trachea ireo bao roa ireo (izany hoe manintona; sary 3b), dia nipoitra lava kokoa ny tady MP ary teo amin'ny rindrin'ny trachea no nipetraka fa tsy teo amin'ny dorsal surface. trachea (jereo Fanampiny).Video S9:MP5).Na izany aza, ny fifantohana avo lenta amin'ny toerana iray (izany hoe, ny dorsal surface amin'ny trachea) dia tsy hita taorian'ny fampiasana ranon-javatra tamin'ny fampiasana fitaovana andriamby roa, izay matetika mitranga amin'ny fitaovana andriamby tokana.Avy eo, rehefa natsangana ny andriamby iray mba handroahana bao mifanohitra (sary 3c), dia tsy nitombo ny isan'ny singa hita eo amin'ny sehatry ny fijery taorian'ny fandefasana.Sarotra ny fametrahana ireo rindrankajy andriamby roa noho ny herin'ny sahan'andriamby avo izay mahasarika na manosika ny andriamby tsirairay avy.Avy eo dia novaina ho andriamby tokana mifanitsy amin'ny lalan-drivotra ilay setup fa mandalo amin'ny lalan-drivotra amin'ny zoro 90 degre ka ny tsipika hery dia niampita ny rindrin'ny tracheal orthogonally (sary 3d), orientation natao hamaritana ny mety hisian'ny fivondronan'ny singa amin'ny ny rindrina lateral.tandremo.Na izany aza, amin'ity fanamafisana ity dia tsy nisy hetsika fanangonam-bokatra MF na hetsika magnetika.Mifototra amin'ireo valiny rehetra ireo, dia nofidina ny fanamafisana misy andriamby tokana sy orientation 30 degre ho an'ny fandalinana in vivo momba ny mpitatitra fototarazo (sary 3a).
Rehefa nalaina sary imbetsaka ilay biby avy hatrany taorian'ny nanaovana sorona olombelona, ​​ny tsy fisian'ny fihetsehan'ny tavy manelingelina dia midika fa ny tsipika kely kokoa sy fohy kokoa dia azo fantarina ao amin'ny sahan'ny intercartilaginous mazava, 'mihozongozona' mifanaraka amin'ny fihetsik'ilay andriamby.jereo tsara ny fisiana sy ny fihetsehan'ny singa MP6.
Ny titer an'ny LV-LacZ dia 1.8 x 108 IU / mL, ary taorian'ny fampifangaroana 1: 1 amin'ny CombiMag MP (MP6), ny biby dia natsindrona tamin'ny 50 µl ny dosie tracheal 9 x 107 IU / ml ny fiara LV (izany hoe 4.5). x 106 TU/rat).)).Ao anatin'ireo fanadihadiana ireo, fa tsy manetsika ny andriamby mandritra ny asa, dia nametraka ny andriamby amin'ny toerana iray izahay mba hamaritana raha azo atao ny LV transduction (a) hatsaraina raha ampitahaina amin'ny fandefasana vector raha tsy misy sahan'andriamby, ary (b) raha mety ny lalan-drivotra. mifantoka.Ny sela afindra ao amin'ny faritra kendrena magnetika ao amin'ny trakta taovam-pisefoana ambony.
Ny fisian'ny andriamby sy ny fampiasana CombiMag miaraka amin'ny LV vectors dia toa tsy misy fiantraikany ratsy amin'ny fahasalaman'ny biby, toy ny protocole fanaterana vector LV mahazatra.Ny sary eo anoloana amin'ny faritry ny trachea iharan'ny fikorontanan'ny mekanika (sary fanampiny 1) dia nampiseho fa ny tarika LV-MP voatsabo dia manana haavon'ny transduction avo kokoa amin'ny fisian'ny andriamby (sary 9a).Vitsy ihany ny loko manga LacZ no hita tao amin'ny vondrona mpanara-maso (sary 9b).Ny fampitomboana ny faritra voajanahary X-Gal dia nampiseho fa ny fitantanana ny LV-MP eo anatrehan'ny sahan'andriamby dia niteraka fanatsarana manodidina ny 6 heny (sary 9c).
Ohatra amin'ny sary mitambatra mampiseho fifindran'ny trachea miaraka amin'ny LV-MP (a) amin'ny fisian'ny sahan'andriamby ary (b) amin'ny tsy fisian'ny andriamby.(c) Fanatsarana manan-danja amin'ny statistika amin'ny faritra ara-dalàna amin'ny transduction LacZ ao amin'ny trachea amin'ny fampiasana andriamby (* p = 0.029, t-test, n = 3 isaky ny vondrona, midika ± fahadisoana mahazatra amin'ny salan'isa).
Ny fizarana tsy miandany haingana mena (ohatra aseho amin'ny sary fanampiny 2) dia nanondro fa ny sela misy loko LacZ dia hita ao amin'ny santionany mitovy ary amin'ny toerana mitovy amin'ny voalaza teo aloha.
Ny fanamby lehibe amin'ny fitsaboana fototarazo amin'ny lalan-drivotra dia mijanona amin'ny fametrahana mazava tsara ireo poti-pitaterana any amin'ny faritra mahaliana sy ny fanatontosana ny fahombiazan'ny transduction avo lenta ao amin'ny havokavoka finday amin'ny fisian'ny fikorianan'ny rivotra sy ny fivoahan'ny mucus mavitrika.Ho an'ny mpitatitra LV natao hitsaboana aretina taovam-pisefoana amin'ny cystic fibrosis, ny fampitomboana ny fotoana ipetrahan'ny poti-pitaterana ao amin'ny lalan-drivotra conductive dia tanjona tsy tratrarina hatramin'izao.Araka ny nomarihin'i Castellani et al., ny fampiasana ny sahan'andriamby mba hanatsarana ny transduction dia manana tombony amin'ny fomba fanaterana fototarazo hafa toy ny electroporation satria afaka manambatra ny fahatsorana, ny toekarena, ny fanaterana eo an-toerana, ny fitomboan'ny fahombiazana ary ny fotoana fohy kokoa.ary mety ho fatra ambany kokoa amin'ny fiara10.Na izany aza, ny fametrahana in vivo sy ny fitondran-tenan'ireo singa magnetika ao amin'ny lalan-drivotra eo ambany fitarihan'ny hery magnetika ivelany dia tsy nofaritana hatrizay, ary raha ny marina, ny fahafahan'ity fomba ity hampitombo ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo amin'ny lalan-drivotra velona dia tsy naseho tao amin'ny vivo.
Ny fanandramana in vitro nataonay tamin'ny PCXI synchrotron dia nampiseho fa ny singa rehetra notsapainay, afa-tsy ny polystyrène MP, dia hita tao amin'ny fananganana sary nampiasainay.Eo anatrehan'ny sahan'andriamby, ny sahan'andriamby dia mamorona tady, ny halavany dia mifandray amin'ny karazana poti sy ny tanjaky ny sahan'andriamby (izany hoe ny akaiky sy ny fihetsiky ny andriamby).Araka ny aseho ao amin'ny sary 10, ny tady izay hitantsika dia miforona rehefa lasa andriamby ny singa tsirairay ary mampirisika ny sahan'andriamby eo an-toerana.Ireo saha misaraka ireo dia miteraka poti hafa mitovitovy amin'izany hanangona sy hifandray amin'ny fihetsehan'ny tady vondrona noho ny hery eo an-toerana avy amin'ny herin'ny fanintonana eo an-toerana sy ny fandroahana ireo singa hafa.
Kisary mampiseho (a, b) rojo-potaka miforona ao anaty kapilara feno ranoka sy (c, d) trachea feno rivotra.Mariho fa ny capillaries sy ny trachea dia tsy voasarika amin'ny haavony.Ny tontonana (a) koa dia misy famaritana ny MF misy poti-Fe3O4 voalamina ao anaty rojo.
Rehefa nifindra teo ambonin'ny capillary ny andriamby, dia tonga teo amin'ny tokonam-baravarana manakiana ho an'ny MP3-5 misy Fe3O4 ny zoro amin'ny tadin'ny singa, ary avy eo dia tsy nijanona teo amin'ny toerany tany am-boalohany intsony ny tadin'ny singa, fa nifindra tany amin'ny toerana vaovao.andriamby.Mety hitranga izany fiantraikany izany satria malama tsara ny velaran'ny kapilara fitaratra mba ahafahan'ity hetsika ity hitranga.Mahaliana fa ny MP6 (CombiMag) dia tsy nanao toy izany, angamba noho ny kely kokoa ny poti, nanana coating hafa na fiampangana ambonin'ny, na ny ranon-javatra tompon'ny fiara nisy fiantraikany amin'ny fahafahany mihetsika.Ny fifanoherana amin'ny sarin'ny particle CombiMag dia malemy kokoa, izay manondro fa ny ranon-javatra sy ny poti dia mety manana hakitroky mitovy ary noho izany dia tsy afaka mihetsika mora foana.Mety ho tafahitsoka ihany koa ny potika raha toa ka mandeha haingana loatra ny andriamby, izay manondro fa ny tanjaky ny sahan'andriamby dia tsy afaka mandresy foana ny fifandonana misy eo amin'ireo singa ao amin'ny fluid, izay milaza fa ny tanjaky ny sahan'andriamby sy ny elanelana misy eo amin'ny andriamby sy ny faritra kendrena dia tsy tokony ho tonga toy ny a mahagaga.manan-danja.Ireo vokatra ireo dia manondro ihany koa fa na dia afaka misambotra microparticles maro mikoriana amin'ny faritra kendrena aza ny andriamby, dia azo inoana fa tsy azo ianteherana ny andriamby mba hamindra ireo poti-pokontany CombiMag eny ambonin'ny trachea.Noho izany, nanatsoaka hevitra izahay fa ny fandalinana in vivo LV MF dia tokony hampiasa saha static static mba hikendry faritra manokana amin'ny hazon'ny rivotra.
Rehefa tafiditra ao amin'ny vatana ny poti dia sarotra ny mamantatra azy ireo amin'ny tontolon'ny sela mihetsiketsika be pitsiny ao amin'ny vatana, saingy nohatsaraina ny fahaiza-misaroka azy ireo tamin'ny alàlan'ny fanosehana ny andriamby mitsivalana eo ambonin'ny trachea mba "mihozongozona" ny tady MP.Na dia azo atao aza ny fanaovana sary amin'ny fotoana tena izy, dia mora kokoa ny manavaka ny fihetsehan'ny poti rehefa avy novonoina tamin'ny fomba olombelona ilay biby.Ny fatran'ny MP dia matetika ambony indrindra amin'ity toerana ity rehefa napetraka teo ambonin'ny faritra misy sary ny andriamby, na dia hita any ambany kokoa aza ny singa sasany amin'ny trachea.Tsy toy ny fandalinana in vitro, ny poti dia tsy azo taritina midina any amin'ny trachea amin'ny alàlan'ny hetsiky ny andriamby.Ity fikarohana ity dia mifanaraka amin'ny fomba fiasan'ny mucus izay mandrakotra ny tambonin'ny trachea amin'ny ankapobeny ireo singa voafoka, mamandrika azy ireo ao amin'ny mucus ary avy eo manadio azy ireo amin'ny alàlan'ny mekanika fanadiovana muco-ciliary.
Noheverinay fa ny fampiasana andriamby ambony sy ambanin'ny trachea mba hisarihana (sary 3b) dia mety hiteraka sahan'andriamby mitovy kokoa, fa tsy sahan'andriamby izay mifantoka be amin'ny teboka iray, izay mety hiteraka fizarana mitovy kokoa amin'ny singa..Na izany aza, ny fandinihanay mialoha dia tsy nahita porofo mazava hanohanana an'io hevitra io.Toy izany koa, ny fametrahana andriamby roa mba handroaka (sary 3c) dia tsy nahatonga ny fipetrahan'ny singa bebe kokoa ao amin'ny faritry ny sary.Ireo valim-pikarohana roa ireo dia mampiseho fa tsy manatsara ny fanaraha-maso eo an-toerana ny tondro MP ny fametrahana andriamby roa, ary sarotra ny mampifanaraka ny hery andriamby mahery aterak'izany, ka mahatonga ity fomba ity ho tsy azo ampiharina.Toy izany koa, ny fandrindrana ny andriamby etsy ambony sy manerana ny trachea (sary 3d) dia tsy nampitombo ny isan'ny singa tavela ao amin'ny faritra misy sary.Ny sasany amin'ireo fanitsiana hafa ireo dia mety tsy hahomby satria miteraka fihenan'ny tanjaky ny sahan'andriamby ao amin'ny faritra deposition.Noho izany, ny fanamafisam-peo tokana amin'ny 30 degre (sary 3a) dia heverina ho fomba fitsapana tsotra sy mahomby indrindra amin'ny vivo.
Ny fandinihana LV-MP dia naneho fa rehefa natambatra tamin'ny CombiMag ny vectors LV ary naterina taorian'ny fikorontanana ara-batana teo anatrehan'ny sahan'andriamby, dia nitombo be ny haavon'ny transduction tao amin'ny trachea raha oharina amin'ny fanaraha-maso.Mifototra amin'ny fandalinana synchrotron imaging sy ny valin'ny LacZ, ny sahan'andriamby dia toa afaka mitazona ny LV ao amin'ny trachea ary mampihena ny isan'ny poti-vector izay miditra lalina ao amin'ny havokavoka.Ny fanatsarana ny kendrena toy izany dia mety hitarika ho amin'ny fahombiazana ambony kokoa sady mampihena ny titer aterina, ny fifindrana tsy misy lasibatra, ny voka-dratsin'ny mamaivay sy ny hery fiarovana, ary ny vidin'ny famindrana fototarazo.Ny tena zava-dehibe, araka ny filazan'ny mpanamboatra, CombiMag dia azo ampiasaina miaraka amin'ny fomba famindrana fototarazo hafa, anisan'izany ny virosy viraliny hafa (toy ny AAV) sy ny asidra nucleic.